生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞時如何降低乳酸的影響？

銨產(chǎn)量過多、乳酸產(chǎn)量過剩、營養(yǎng)限制或與營養(yǎng)補給、添加堿以控制 pH 值相關(guān)的高滲應(yīng)激等因素，使得生物反應(yīng)器中的細胞密度被限制。

為了部分克服這些因素，使用乳酸補充和適應(yīng)LSA 技術(shù)是減少銨和乳酸產(chǎn)生的一種簡單方法。使用這種簡單的方法，可以實現(xiàn)了將近乳酸產(chǎn)量的大幅度減少，同時在分批搖瓶培養(yǎng)中減少了 50% 的銨產(chǎn)量。在隨后的補料分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)中，使用Biosen C-Line 乳酸分析儀測定乳酸產(chǎn)量減少了近8八倍。甚至可以實現(xiàn) 3500 萬個細胞/mL 的活細胞密度和 2.73 億個細胞-天/mL 的完整活細胞天數(shù)。

減少乳酸和銨鹽產(chǎn)量的方法總結(jié)

在動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，許多研究人員觀察到乳酸和銨積累會嚴(yán)重影響到 細胞的生長。 60多年來，科學(xué)家已開發(fā)出多種方法來減少乳酸 和銨的產(chǎn)生。

常用方法匯總見表

        大約在過去 35 年里，隨著生物制藥行業(yè)生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)從低密度分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)向高密度補料分批培養(yǎng)，乳酸和銨積累方面 的挑戰(zhàn)大幅增加。減少乳酸積累制造創(chuàng)新藥物的基本要求是：

(1)在所有與工業(yè)相關(guān)的細胞系和工藝生產(chǎn)過程中，將乳酸和銨的產(chǎn)量降低到足夠低的水平，以免對細胞生長和產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，

(2)在根據(jù)當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP) 運行的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中。

  為減少乳酸積累曾經(jīng)嘗試過用替代糖替代葡萄糖，當(dāng)時，人們并未廣泛認(rèn)識到銨積累可能是一個問題，因此未報告有關(guān)銨水平的數(shù)據(jù)(NR)。事實上，許多早期這樣的方法以及許多目前的方法都減少了乳酸的產(chǎn)生，但增加了銨的產(chǎn)生。當(dāng)測試用于補料分批培養(yǎng)時，替代糖（例如半乳糖）有時會導(dǎo)致與葡萄糖類似的生長。

   相對低水平的銨，通常在 2到10 mM 之間，可能對細胞生長和生產(chǎn)力以及糖基化產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至可能對某些重組糖蛋白的生物活性、穩(wěn)定性和/或免疫原性產(chǎn)生負(fù)面影響。銨是動物細胞培養(yǎng)中重要的抑制性代謝物之一。銨的負(fù)面影響通常在比乳酸（例如 20–40 mM）低大約十倍（例如 2–4 mM）的濃度下實現(xiàn) 。因此，以氨的少量增加為代價來減少乳酸當(dāng)然是不可取的。

        將培養(yǎng)基中的葡萄糖控制在低水平——以限制葡萄糖對細胞的供應(yīng)——已被用于減少乳酸產(chǎn)生超過三十年。這可以通過多種方式實現(xiàn)，例如直接測量和自動或手動反饋控制葡萄糖水平。當(dāng)葡萄糖而非谷氨酰胺被控制在低水平時，通常會發(fā)生葡萄糖攝取和乳酸生成的理想減少，但這通常與谷氨酰胺攝取和銨生成的不良增加密切相關(guān). 因此，為了盡量減少乳酸和銨的產(chǎn)生，可能需要同時控制葡萄糖和谷氨酰胺。

關(guān)于生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)過程中的葡萄糖乳酸含量的測定可以使用Biosen C-Line 乳酸分析儀，該儀器使用外部傳感器系統(tǒng)對葡萄糖和乳酸水平進行樣品測試，根據(jù)反應(yīng)罐內(nèi)的養(yǎng)分消耗和細胞代謝狀態(tài)來適當(dāng)進行補料。

目前，許多研究人員還嘗試開發(fā)代謝工程方法來減少乳酸或銨的產(chǎn)生。總的來說，事實證明，通過基因工程改善代謝表型比 1980 年代最初設(shè)想的要困難得多。所以，除了 GS 方法之外，迄今為止，還沒有其他減少乳酸 或氨產(chǎn)量的代謝工程方法在工業(yè)中得到廣泛采用。

其實，當(dāng)前有四種簡單而常用的減少乳酸和銨產(chǎn)量的方法：

(1) 降低培養(yǎng)溫度

(2) 降低培養(yǎng) pH

         (3) 向培養(yǎng)基補充銅

         (4) 選擇具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆。

         盡管所有這些方法都被普遍采用，但需要注意的是，這些方法均不能普遍減少乳酸和氨的產(chǎn)生。溫度和 pH 變化通常根據(jù)具體情況進行優(yōu)化，可能對細胞生長和/或產(chǎn)品質(zhì)量 產(chǎn)生負(fù)面 或正面 影響。雖然 pH 值下降通常會減少乳酸產(chǎn)量 ， 但它也會導(dǎo)致谷氨酰胺 消耗和銨產(chǎn)量增加 。銅補充劑是一種簡單的方法，但不會減少所有相關(guān)細胞系的乳酸產(chǎn)量，并且還會對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生積極或消極的影響。 選擇具有乳酸消耗 (LC) 表型的克隆本質(zhì)上并不普遍，因為它需要具有特定生產(chǎn)力、產(chǎn)品質(zhì)量或其他潛力的克隆可能會由于缺乏 LC 表型而被丟棄。對于某些克隆，LC 表型可能由于未知因素偶爾會丟失，即使在經(jīng)過驗證的 cGMP 工藝生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品中也是如此。

   LSA 技術(shù) 減少工業(yè)細胞培養(yǎng)中乳酸和銨產(chǎn)量

     近年來，一種減少生物反應(yīng)器動物細胞培養(yǎng)中乳酸和銨產(chǎn)量的新方法被提出。這種方法就是LSA 技術(shù)，它主要采用乳酸補充培養(yǎng)基等方式來實現(xiàn)。使用該技術(shù)，補料分批培養(yǎng)物可生長至每毫升 3500 萬個細胞的活細胞密度。這個數(shù)據(jù)遠高于行業(yè)所公布 的每毫升5-45 百萬個細胞的值。同樣，實現(xiàn)的每毫升 2.73 億個細胞日的 IVCD 值也與行業(yè)所公布的每毫升30-2.75 億個細胞日的值相當(dāng)。

LSA 技術(shù)作為一項新興起的技術(shù)在細胞培養(yǎng)行業(yè)尤其是大規(guī)模細胞培養(yǎng)行業(yè)、生物制藥行業(yè)發(fā)揮著重要作用。

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